Exportação de mRNAs do núcleo para o Citoplasma : análise do papel da proteína sub2 em Trypanosoma cruzi e Toxoplasma gondii

Orientadora : Profa. Dra. Andréa Rodrigues ÁvilaCo-orientador : Prof. Dr.Stenio Perdigão FragosoTese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular. Defesa: Curitiba, 30/04/2014Inclui referênciasÁrea de concentração : Biologia celular e molecularResumo: A doença de Chagas e toxoplasmose são problemas de saúde pública no Brasil e entender com detalhes a biologia dos agentes causais, T. cruzi e T. gondii respectivamente, pode ser um ponto crucial para gerar informações relevantes voltadas para o desenvolvimento de tratamento efetivo no combate a estas doenças. No entanto, a busca de novos alvos para quimioterapia de algumas doenças parasitárias esbarra, por exemplo, na ausência de ferramentas que possibilitem o estudo da função de genes essenciais para a sobrevivência do organismo. Dentro desta problemática, o objetivo central deste estudo é a identificação de proteínas envolvidas no transporte nucleocitoplasmático de RNAs, mais especificamente a exportação de mRNAs, com a utilização de ferramentas de genética reversa para análise de proteínas essenciais envolvidas nestas vias em T. cruzi e T. gondii. Além disso, T. gondii tem sido o modelo de estudo escolhido por diversos grupos, uma vez que dispõe de várias ferramentas de genética reversa consideradas inviáveis ou laboriosas em outros parasitas (como Plasmodium ou Trypanosoma). A escolha do tema foi baseada em dois fatos principais: a) dentro do contexto de eventos moleculares essenciais, o transporte de RNA mensageiro (mRNA) ao local de tradução é uma etapa essencial e crucial na seleção de genes a serem expressos em uma célula eucariótica; b) escassez de publicações envolvendo diversos grupos de parasitas, demonstrando ser um tema da pesquisa básica em parasitologia que necessita ser explorado. Os dados gerados neste estudo permitiram identificar que a maioria das proteínas relacionadas com a exportação de mRNAs não são tão conservadas ao longo da filogenia de eucariotos, principalmente em relação aos protozoários que divergiram na base da árvore filogenética. A exceção encontrada foi Sub2/UAP56, uma proteína relacionada com exportação de mRNAs em fungos e humanos, respectivamente, que se encontra altamente conservada ao longo da filogenia de eucariotos. Em T. cruzi foi observado que TcSub2 é uma proteína nuclear, relacionada com alguns sítios de transcrição por RNA Polimerase II e essencial, não sendo possível obter o nocaute duplo do respectivo gene. Em T. brucei e T. gondii foi observado que a diminuição gradual das proteínas em questão, TbSub2 e TgUAP56 respectivamente, resulta em acúmulo de mRNAs poliadenilados nos núcleos afetando a exportação dos mRNAs e resultando em morte celular. A partir da observação da participação de proteínas ortólogas de Sub2 na exportação de mRNAs em parasitas, a outra parte deste estudo foi identificar proteínas associadas a TcSub2 para iniciar o entendimento sobre esta via bem como verificar a presença de proteínas específicas e provavelmente essenciais de parasitas para futuros estudos funcionais.Abstract: Chagas disease and toxoplasmosis are public health issues in Brazil and understanding in detail the biology of its causative agents, T. cruzi and T. gondii respectively, could generate relevant information to develop effective treatment(s) against these diseases. The search for new chemotherapy targets against parasitic disease faces a number of challenges as the lack of tools that enable the study of essential gene function in parasites. Taking this into consideration, the aim of this study was to develop reverse genetic tools to identify and analyse essential proteins in T. cruzi and T. gondii, in particular those involved in nucleocytoplasmic transport of RNAs, specifically in mRNA export. T. gondii has served as model organism because it has an ample wide repertoire of reverse genetic tools. However, transferring these tools to other parasites, i.e. Plasmodium or Trypanosoma, has not been a straightforward task. The hypothesis of this study was based on two main facts: a) the transport of mRNA to the site of translation, within the context of key molecular events, is an essential step in the selection of genes to be expressed in an eukaryotic cell and b) the lack of publications in this topic in parasites proving to be a subject of basic research in parasitology that needs to be explored. The data obtained in this study showed that most proteins related to the export of mRNAs are not well conserved throughout eukaryotic phylogeny, especially eukaryotes that diverged at the base of the phylogenetic tree, the parasites. An exception to this observation was Sub2/UAP56, a protein directly related to export of mRNAs in yeast and human respectively, which is highly conserved throughout eukaryotic phylogeny. In T. cruzi, TcSub2 is an essential nuclear protein, associated with a number of sites of RNA polymerase II transcription and, a double knockout of the gene is lethal. It has been observed in T. brucei and T. gondii that the knockdown of TbSub2 and TgUAP56 respectively, results in nuclear accumulation of polyadenylated mRNAs, effectively reducing mRNA export and leading to cell death. Extending these observations that highlight the important role of Sub2 orthologues in mRNA export, we aim to identify proteins partners of TcSub2 to better understand this pathway in T. cruzi and verify the presence of specific and likely essential proteins for future studies in this parasite

Identificação de proteínas envolvidas na exportação de RNA mensageiro do núcleo para o citoplasma em trypanosoma cruzi : caracterização funcional de TcSub2

Orientador : Andréa Rodrigues ÁvilaCo-orientador : Federico Guillermo HoffmanDissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular. Defesa: Curitiba, 30/03/2010Inclui bibliografiaÁrea de concentração : Biologia celular e molecularResumo: Diferentes espécies de RNAs são exportadas do núcleo por vias especializadas em eucariotos. Nos eucariotos superiores a exportação nuclear da maioria das espécies de RNAs, como microRNAs (miRNAs), rRNAs, pequenos RNAs nucleares RNAs (snRNAs) e RNA transportadores (tRNAs), seguem o modelo de transporte via exportinas e RanGTP, onde exportinas específicas estão envolvidas com diferentes vias de exportação. No entanto, a exportação nuclear da maioria dos RNAs mensageiros (mRNAs) não segue a via dependente de RanGTP. A maquinaria de exportação de mRNAs está altamente integrada com o processamento de mRNA e inclui um conjunto específico de adaptadores de transporte, proteínas ligadoras de RNAs (RBPs), RNA helicases e proteínas associadas ao complexo de poro nuclear (NPC). Ainda não se sabe se as vias de exportação de RNAs estão conservadas em eucariotos pertencentes às linhagens basais e a pergunta de como o complexo de exportação de RNAs era no eucarioto ancestral (LECA) ainda permanece em aberto. Um dos nossos objetivos foi reconstruir a história evolutiva de diferentes vias de exportação de RNAs em eucariotos. Para isso, nós investigamos o genoma de eucariotos para a busca de proteínas homólogas envolvidas na exportação de RNAs em metazoários e fungos, utilizando como sementes de busca as proteínas de humanos e fungos funcionalmente aracterizadas. Os resultados da genômica comparativa indicaram que muitas das proteínas-chave envolvidas em diferentes vias de exportação de RNAs dependente de RanGTP estão conservadas em eucariotos basais e então nós inferimos que ortólogos destas proteínas já estavam presentes em LECA. A exportação de mRNA é a mais complexa eu eucariotos e a menos conservada entre essas linhagens basais examinadas neste estudo. Isto sugere que a via de exportação de mRNA em eucariotos basais é diferente do que é observado em eucariotos superiores. Para entender melhor a exportação de mRNAs em linhagens basais de eucariotos, decidimos investigar a função de algumas proteínas altamente conservadas em tripanossomatídeos, agentes causais de doenças humanas fatais. A proteína mais conservada ao longo da filogenia de eucariotos, determinada pela nossa análise, foi Sub2/UAP56, um componente do complexo multiprotéico que conecta transcrição com exportação de mRNA; TREX (Transcription/Export). Ela é uma proteína nuclear em Trypanosoma brucei e Trypanosoma cruzi. Análises de imunocitoquímica ultraestrutural mostraram que a proteína Sub2 de T. cruzi (TcSub2) está localizada em sítios dispersos no núcleo, com ausência de marcação no nucléolo, e na interface entre as áreas de cromatina densa e frouxa, indicando a associação com sítios de transcrição. Este resultado foi analisado por ensaios de ncorporação de BrUTP. Observamos que esta proteína colocaliza com sítios de transcrição por RNA Polimerase II, corroborando com os resultados de microscopia eletrônica. Essas evidências sugerem ortemente que TcSub2 participa do metabolismo nuclear de mRNA. Nós estamos atualmente investigando o papel de Sub2 de T. cruzi e T. brucei para elucidar se está de fato relacionada com a exportação de mRNAs em tripanossomatídeos. Além disso, o nocaute duplo do gene de TcSub2 é letal em T. cruzi e ensaios de interferência de RNA (RNAi) do gene TbSub2 altera o crescimento celular de T. brucei, indicando que é uma proteína essencial em ripanossomatídeos, similar em outros eucariotos.Abstract: Different RNA species are exported from the nucleus by specialized pathways in eukaryotes. In "higher" eukaryotes, the nuclear export of most RNA species, such as microRNAs (miRNAs), rRNAs, small uclear RNAs (snRNAs), and transfer RNAs (tRNAs), has been shown to follow the RanGTP-exportin model of transport, and specific exportins are involved with the different export pathways. However, nuclear export of most mRNAs does not follow the RanGTP-exportin pathway. The mRNA export machinery is highly integrated with mRNA processing, and it includes a different set of nuclear transport adaptors plus other mRNA binding proteins, RNA helicases, and nuclear pore complex (NPC) associated proteins. It is not known whether the RNA export pathways are conserved in deeply diverging members of the eukaryotic lineage, and the question of how complex the nucleocytoplasmic export of RNA was in the last eukaryotic common ancestor (LECA) remains open. One of our objectives was to reconstruct the evolutionary history of the different RNA export pathways across eukaryotes. To do so, we screened an array of eukaryotic genomes for the presence of homologs of the proteins involved in RNA export in metazoa and fungi, using human and yeast proteins as queries. Results from our genomic comparisons indicate that several of the key proteins involved in the different Randependent RNA export pathways are conserved across most eukaryotic lineages, and thus we infer that orthologs of them were highly likely to have been already present in LECA. The mRNA export pathway is the most complex and the least conserved among those xamined in this study, suggesting that mRNA export among deeply diverging eukaryotic lineages is different from what is observed in extant "higher" eukaryotes. To better understand mRNA export in deeply iverging eukaryote lineages, we decided to investigate the function of some well conserved proteins in trypanosomatid protozoa, causative agents of deadly human diseases. The most conserved protein across all eukaryotes as determined by our analysis was Sub2/UAP56, a component of the multiprotein complex that connects transcription with mRNA export, TREX (Transcription/Export). It is a nuclear protein in Trypanosoma brucei and Trypanosoma cruzi. Ultrastructural immunocytochemistry an lysis showed that T. cruzi Sub2 is localized in dispersed foci all over the nuclei, excluding nucleolus, and at the interface between dense and non-dense chromatin areas indicating its association to transcription sites. This result was further analyzed by BrUTP incorporation assays. We observed that this protein is co-localized with RNA pol II transcription sites corroborating our results. Taken together, these evidences strongly suggest that TcSub2 participates in nuclear mRNA metabolism. We are currently investigating the role of T. cruzi and T. brucei Sub2 to elucidate if they are in fact components of mRNA export in trypanosomatids. Besides, the double knockout of the TcSub2 gene is lethal in T. cruzi and RNA interference assays (RNAi) of TbSub2 causes a growth defect in T. brucei, indicating that it is an essential protein for trypanosomes, similar to other eukaryotes

Proteomics uncovers novel components of an interactive protein network supporting RNA export in trypanosomes

In trypanosomatids, transcription is polycistronic and all mRNAs are processed by trans-splicing, with export mediated by noncanonical mechanisms. Although mRNA export is central to gene regulation and expression, few orthologs of proteins involved in mRNA export in higher eukaryotes are detectable in trypanosome genomes, necessitating direct identification of protein components. We previously described conserved mRNA export pathway components in Trypanosoma cruzi, including orthologs of Sub2, a component of the TREX complex, and eIF4AIII (previously Hel45), a core component of the exon junction complex (EJC). Here, we searched for protein interactors of both proteins using cryomilling and mass spectrometry. Significant overlap between TcSub2 and TceIF4AIII-interacting protein cohorts suggests that both proteins associate with similar machinery. We identified several interactions with conserved core components of the EJC and multiple additional complexes, together with proteins specific to trypanosomatids. Additional immunoisolations of kinetoplastid-specific proteins both validated and extended the superinteractome, which is capable of supporting RNA processing from splicing through to nuclear export and cytoplasmic events. We also suggest that only proteomics is powerful enough to uncover the high connectivity between multiple aspects of mRNA metabolism and to uncover kinetoplastid-specific components that create a unique amalgam to support trypanosome mRNA maturation

An Essential Nuclear Protein in Trypanosomes Is a Component of mRNA Transcription/Export Pathway

In eukaryotic cells, different RNA species are exported from the nucleus via specialized pathways. The mRNA export machinery is highly integrated with mRNA processing, and includes a different set of nuclear transport adaptors as well as other mRNA binding proteins, RNA helicases, and NPC-associated proteins. The protozoan parasite Trypanosoma cruzi is the causative agent of Chagas disease, a widespread and neglected human disease which is endemic to Latin America. Gene expression in Trypanosoma has unique characteristics, such as constitutive polycistronic transcription of protein-encoding genes and mRNA processing by trans-splicing. In general, post-transcriptional events are the major points for regulation of gene expression in these parasites. However, the export pathway of mRNA from the nucleus is poorly understood. The present study investigated the function of TcSub2, which is a highly conserved protein ortholog to Sub2/ UAP56, a component of the Transcription/Export (TREX) multiprotein complex connecting transcription with mRNA export in yeast/human. Similar to its orthologs, TcSub2 is a nuclear protein, localized in dispersed foci all over the nuclei —except the fibrillar center of nucleolus— and at the interface between dense and non-dense chromatin areas, proposing the association of TcSub2 with transcription/processing sites. These findings were analyzed further by BrUTP incorporation assays and confirmed that TcSub2 is physically associated with active RNA polymerase II (RNA pol II), but not RNA polymerase I (RNA pol I) or Spliced Leader (SL) transcription, demonstrating participation particularly in nuclear mRNA metabolism in T. cruzi. The double knockout of the TcSub2 gene is lethal in T. cruzi, suggesting it has an essential function. Alternatively, RNA interference assays were performed in Trypanosoma brucei. It allowed demonstrating that besides being an essential protein, its knockdown causes mRNA accumulation in the nucleus and decrease of translation levels, reinforcing that Trypanosoma-Sub2 (Tryp-Sub2) is a component of mRNA transcription/export pathway in trypanosomes

Comparative genomics of proteins involved in RNA nucleocytoplasmic export

Background: The establishment of the nuclear membrane resulted in the physical separation of transcription and translation, and presented early eukaryotes with a formidable challenge: how to shuttle RNA from the nucleus to the locus of protein synthesis. In prokaryotes, mRNA is translated as it is being synthesized, whereas in eukaryotes mRNA is synthesized and processed in the nucleus, and it is then exported to the cytoplasm. In metazoa and fungi, the different RNA species are exported from the nucleus by specialized pathways. For example, tRNA is exported by exportin-t in a RanGTP-dependent fashion. By contrast, mRNAs are associated to ribonucleoproteins (RNPs) and exported by an essential shuttling complex (TAP-p15 in human, Mex67-mtr2 in yeast) that transports them through the nuclear pore. The different RNA export pathways appear to be well conserved among members of Opisthokonta, the eukaryotic supergroup that includes Fungi and Metazoa. However, it is not known whether RNA export in the other eukaryotic supergroups follows the same export routes as in opisthokonts. Methods: Our objective was to reconstruct the evolutionary history of the different RNA export pathways across eukaryotes. To do so, we screened an array of eukaryotic genomes for the presence of homologs of the proteins involved in RNA export in Metazoa and Fungi, using human and yeast proteins as queries. Results: Our genomic comparisons indicate that the basic components of the RanGTP-dependent RNA pathways are conserved across eukaryotes, and thus we infer that these are traceable to the last eukaryotic common ancestor (LECA). On the other hand, several of the proteins involved in RanGTP-independent mRNA export pathways are less conserved, which would suggest that they represent innovations that appeared later in the evolution of eukaryotes. Conclusions: Our analyses suggest that the LECA possessed the basic components of the different RNA export mechanisms found today in opisthokonts, and that these mechanisms became more specialized throughout eukaryotic evolution

Exportação de mRNAs do núcleo para o Citoplasma : análise do papel da proteína sub2 em Trypanosoma cruzi e Toxoplasma gondii

Orientadora : Profa. Dra. Andréa Rodrigues ÁvilaCo-orientador : Prof. Dr.Stenio Perdigão FragosoTese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular. Defesa: Curitiba, 30/04/2014Inclui referênciasÁrea de concentração : Biologia celular e molecularResumo: A doença de Chagas e toxoplasmose são problemas de saúde pública no Brasil e entender com detalhes a biologia dos agentes causais, T. cruzi e T. gondii respectivamente, pode ser um ponto crucial para gerar informações relevantes voltadas para o desenvolvimento de tratamento efetivo no combate a estas doenças. No entanto, a busca de novos alvos para quimioterapia de algumas doenças parasitárias esbarra, por exemplo, na ausência de ferramentas que possibilitem o estudo da função de genes essenciais para a sobrevivência do organismo. Dentro desta problemática, o objetivo central deste estudo é a identificação de proteínas envolvidas no transporte nucleocitoplasmático de RNAs, mais especificamente a exportação de mRNAs, com a utilização de ferramentas de genética reversa para análise de proteínas essenciais envolvidas nestas vias em T. cruzi e T. gondii. Além disso, T. gondii tem sido o modelo de estudo escolhido por diversos grupos, uma vez que dispõe de várias ferramentas de genética reversa consideradas inviáveis ou laboriosas em outros parasitas (como Plasmodium ou Trypanosoma). A escolha do tema foi baseada em dois fatos principais: a) dentro do contexto de eventos moleculares essenciais, o transporte de RNA mensageiro (mRNA) ao local de tradução é uma etapa essencial e crucial na seleção de genes a serem expressos em uma célula eucariótica; b) escassez de publicações envolvendo diversos grupos de parasitas, demonstrando ser um tema da pesquisa básica em parasitologia que necessita ser explorado. Os dados gerados neste estudo permitiram identificar que a maioria das proteínas relacionadas com a exportação de mRNAs não são tão conservadas ao longo da filogenia de eucariotos, principalmente em relação aos protozoários que divergiram na base da árvore filogenética. A exceção encontrada foi Sub2/UAP56, uma proteína relacionada com exportação de mRNAs em fungos e humanos, respectivamente, que se encontra altamente conservada ao longo da filogenia de eucariotos. Em T. cruzi foi observado que TcSub2 é uma proteína nuclear, relacionada com alguns sítios de transcrição por RNA Polimerase II e essencial, não sendo possível obter o nocaute duplo do respectivo gene. Em T. brucei e T. gondii foi observado que a diminuição gradual das proteínas em questão, TbSub2 e TgUAP56 respectivamente, resulta em acúmulo de mRNAs poliadenilados nos núcleos afetando a exportação dos mRNAs e resultando em morte celular. A partir da observação da participação de proteínas ortólogas de Sub2 na exportação de mRNAs em parasitas, a outra parte deste estudo foi identificar proteínas associadas a TcSub2 para iniciar o entendimento sobre esta via bem como verificar a presença de proteínas específicas e provavelmente essenciais de parasitas para futuros estudos funcionais.Abstract: Chagas disease and toxoplasmosis are public health issues in Brazil and understanding in detail the biology of its causative agents, T. cruzi and T. gondii respectively, could generate relevant information to develop effective treatment(s) against these diseases. The search for new chemotherapy targets against parasitic disease faces a number of challenges as the lack of tools that enable the study of essential gene function in parasites. Taking this into consideration, the aim of this study was to develop reverse genetic tools to identify and analyse essential proteins in T. cruzi and T. gondii, in particular those involved in nucleocytoplasmic transport of RNAs, specifically in mRNA export. T. gondii has served as model organism because it has an ample wide repertoire of reverse genetic tools. However, transferring these tools to other parasites, i.e. Plasmodium or Trypanosoma, has not been a straightforward task. The hypothesis of this study was based on two main facts: a) the transport of mRNA to the site of translation, within the context of key molecular events, is an essential step in the selection of genes to be expressed in an eukaryotic cell and b) the lack of publications in this topic in parasites proving to be a subject of basic research in parasitology that needs to be explored. The data obtained in this study showed that most proteins related to the export of mRNAs are not well conserved throughout eukaryotic phylogeny, especially eukaryotes that diverged at the base of the phylogenetic tree, the parasites. An exception to this observation was Sub2/UAP56, a protein directly related to export of mRNAs in yeast and human respectively, which is highly conserved throughout eukaryotic phylogeny. In T. cruzi, TcSub2 is an essential nuclear protein, associated with a number of sites of RNA polymerase II transcription and, a double knockout of the gene is lethal. It has been observed in T. brucei and T. gondii that the knockdown of TbSub2 and TgUAP56 respectively, results in nuclear accumulation of polyadenylated mRNAs, effectively reducing mRNA export and leading to cell death. Extending these observations that highlight the important role of Sub2 orthologues in mRNA export, we aim to identify proteins partners of TcSub2 to better understand this pathway in T. cruzi and verify the presence of specific and likely essential proteins for future studies in this parasite

Identificação de proteínas envolvidas na exportação de RNA mensageiro do núcleo para o citoplasma em trypanosoma cruzi : caracterização funcional de TcSub2

Orientador : Andréa Rodrigues ÁvilaCo-orientador : Federico Guillermo HoffmanDissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular. Defesa: Curitiba, 30/03/2010Inclui bibliografiaÁrea de concentração : Biologia celular e molecularResumo: Diferentes espécies de RNAs são exportadas do núcleo por vias especializadas em eucariotos. Nos eucariotos superiores a exportação nuclear da maioria das espécies de RNAs, como microRNAs (miRNAs), rRNAs, pequenos RNAs nucleares RNAs (snRNAs) e RNA transportadores (tRNAs), seguem o modelo de transporte via exportinas e RanGTP, onde exportinas específicas estão envolvidas com diferentes vias de exportação. No entanto, a exportação nuclear da maioria dos RNAs mensageiros (mRNAs) não segue a via dependente de RanGTP. A maquinaria de exportação de mRNAs está altamente integrada com o processamento de mRNA e inclui um conjunto específico de adaptadores de transporte, proteínas ligadoras de RNAs (RBPs), RNA helicases e proteínas associadas ao complexo de poro nuclear (NPC). Ainda não se sabe se as vias de exportação de RNAs estão conservadas em eucariotos pertencentes às linhagens basais e a pergunta de como o complexo de exportação de RNAs era no eucarioto ancestral (LECA) ainda permanece em aberto. Um dos nossos objetivos foi reconstruir a história evolutiva de diferentes vias de exportação de RNAs em eucariotos. Para isso, nós investigamos o genoma de eucariotos para a busca de proteínas homólogas envolvidas na exportação de RNAs em metazoários e fungos, utilizando como sementes de busca as proteínas de humanos e fungos funcionalmente aracterizadas. Os resultados da genômica comparativa indicaram que muitas das proteínas-chave envolvidas em diferentes vias de exportação de RNAs dependente de RanGTP estão conservadas em eucariotos basais e então nós inferimos que ortólogos destas proteínas já estavam presentes em LECA. A exportação de mRNA é a mais complexa eu eucariotos e a menos conservada entre essas linhagens basais examinadas neste estudo. Isto sugere que a via de exportação de mRNA em eucariotos basais é diferente do que é observado em eucariotos superiores. Para entender melhor a exportação de mRNAs em linhagens basais de eucariotos, decidimos investigar a função de algumas proteínas altamente conservadas em tripanossomatídeos, agentes causais de doenças humanas fatais. A proteína mais conservada ao longo da filogenia de eucariotos, determinada pela nossa análise, foi Sub2/UAP56, um componente do complexo multiprotéico que conecta transcrição com exportação de mRNA; TREX (Transcription/Export). Ela é uma proteína nuclear em Trypanosoma brucei e Trypanosoma cruzi. Análises de imunocitoquímica ultraestrutural mostraram que a proteína Sub2 de T. cruzi (TcSub2) está localizada em sítios dispersos no núcleo, com ausência de marcação no nucléolo, e na interface entre as áreas de cromatina densa e frouxa, indicando a associação com sítios de transcrição. Este resultado foi analisado por ensaios de ncorporação de BrUTP. Observamos que esta proteína colocaliza com sítios de transcrição por RNA Polimerase II, corroborando com os resultados de microscopia eletrônica. Essas evidências sugerem ortemente que TcSub2 participa do metabolismo nuclear de mRNA. Nós estamos atualmente investigando o papel de Sub2 de T. cruzi e T. brucei para elucidar se está de fato relacionada com a exportação de mRNAs em tripanossomatídeos. Além disso, o nocaute duplo do gene de TcSub2 é letal em T. cruzi e ensaios de interferência de RNA (RNAi) do gene TbSub2 altera o crescimento celular de T. brucei, indicando que é uma proteína essencial em ripanossomatídeos, similar em outros eucariotos.Abstract: Different RNA species are exported from the nucleus by specialized pathways in eukaryotes. In "higher" eukaryotes, the nuclear export of most RNA species, such as microRNAs (miRNAs), rRNAs, small uclear RNAs (snRNAs), and transfer RNAs (tRNAs), has been shown to follow the RanGTP-exportin model of transport, and specific exportins are involved with the different export pathways. However, nuclear export of most mRNAs does not follow the RanGTP-exportin pathway. The mRNA export machinery is highly integrated with mRNA processing, and it includes a different set of nuclear transport adaptors plus other mRNA binding proteins, RNA helicases, and nuclear pore complex (NPC) associated proteins. It is not known whether the RNA export pathways are conserved in deeply diverging members of the eukaryotic lineage, and the question of how complex the nucleocytoplasmic export of RNA was in the last eukaryotic common ancestor (LECA) remains open. One of our objectives was to reconstruct the evolutionary history of the different RNA export pathways across eukaryotes. To do so, we screened an array of eukaryotic genomes for the presence of homologs of the proteins involved in RNA export in metazoa and fungi, using human and yeast proteins as queries. Results from our genomic comparisons indicate that several of the key proteins involved in the different Randependent RNA export pathways are conserved across most eukaryotic lineages, and thus we infer that orthologs of them were highly likely to have been already present in LECA. The mRNA export pathway is the most complex and the least conserved among those xamined in this study, suggesting that mRNA export among deeply diverging eukaryotic lineages is different from what is observed in extant "higher" eukaryotes. To better understand mRNA export in deeply iverging eukaryote lineages, we decided to investigate the function of some well conserved proteins in trypanosomatid protozoa, causative agents of deadly human diseases. The most conserved protein across all eukaryotes as determined by our analysis was Sub2/UAP56, a component of the multiprotein complex that connects transcription with mRNA export, TREX (Transcription/Export). It is a nuclear protein in Trypanosoma brucei and Trypanosoma cruzi. Ultrastructural immunocytochemistry an lysis showed that T. cruzi Sub2 is localized in dispersed foci all over the nuclei, excluding nucleolus, and at the interface between dense and non-dense chromatin areas indicating its association to transcription sites. This result was further analyzed by BrUTP incorporation assays. We observed that this protein is co-localized with RNA pol II transcription sites corroborating our results. Taken together, these evidences strongly suggest that TcSub2 participates in nuclear mRNA metabolism. We are currently investigating the role of T. cruzi and T. brucei Sub2 to elucidate if they are in fact components of mRNA export in trypanosomatids. Besides, the double knockout of the TcSub2 gene is lethal in T. cruzi and RNA interference assays (RNAi) of TbSub2 causes a growth defect in T. brucei, indicating that it is an essential protein for trypanosomes, similar to other eukaryotes

Association Between Health-related Physical Fitness And Body Mass Index Status In Children

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq)The purpose of this study was to investigate the association between body mass index (BMI) status and physical performance in Brazilian children. The analyzed sample was composed of 978 children of both sexes (518 boys and 460 girls), aged 7 to 11 years. BMI and skinfolds were measured, and three motor tests were applied (flexibility, cardiorespiratory fitness, and muscular strength/endurance). In both sexes, overweight/obese children presented poor performance in all motor tests, except flexibility. In general, overweight/obese children have an increased odds ratio (OR) to present poor physical performance (boys: OR = 3.64 for cardiorespiratory fitness, OR = 1.94 for muscular strength/endurance, OR = 1.52 for flexibility; girls: OR = 5.03 for cardiorespiratory fitness and OR = 2.62 for muscular strength/endurance). In conclusion, for both sexes, a poor physical performance in the tests measuring cardiorespiratory fitness and muscular strength/ endurance was associated with the presence of overweight/obesity.203294303Coordination for the Improvement of Higher Education Personnel (CAPES, Brazil)National Council of Scientific and Technological Development (CNPq, Brazil)Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq